密理博ECL发光液的使用方法和注意事项

 

　　密理博ECL发光液的使用方法：

　　1.使用合适的方法进行Western，直至用PBST洗涤二抗。

 

　　2.新鲜配制ECL工作液：试剂I和试剂II按1:1混合后，用双蒸水10倍稀释，混合后即为ECL工作液。须立即使用。

 

　　3.印迹膜蛋白面朝上，用ECL工作液均匀滴加至印迹膜室温孵育1-2分钟。ECL工作液使用量大约为0.125ml/cm2膜或根据个人实验习惯使用。

 

　　4.用平头镊夹住印迹膜，垂直置于吸水纸以吸去多余工作液。

 

　　5.快速将印迹膜置于二层保鲜膜之间，尽量赶尽气泡。

 

　　6.将印迹膜蛋白面朝上，放于X光胶片暗盒内。

 

　　7.在暗室内放入X光片，曝光，显影。

 

　　密理博ECL发光液的注意事项：

　　（1）可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

 

　　（2）长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。曝光不足则条带模糊。

 

　　（3）发光工作液孵育约3分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚至肉眼不可见但可使X光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间。肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使X光胶片感光，因而弱带可曝光1-10小时。如果曝光后条带不佳，可用洗膜缓冲液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL发光和曝光。

 

　　（4）由于密理博ECL发光液极其灵敏，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带，导致失败。

 

　　（5）某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。

 

　　（6）使用肉眼可见的预染色蛋白Marker和荧光-放射自显影曝光标签可精确确定胶片上条带的位置和大小。

 

　　（7）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗体应避免使用NaN3，如必需使用勿超过0.01%。