通用RT-PCR试剂盒（两步法M-MLV）

通用RT-PCR试剂盒(两步法M-MLV)

试剂盒组成：

5×M-MLV Buffer、10×PCR Buffer、MgCl₂(25mM)、RNase-free ddH₂O在2-8℃保存一个月对实验无影响，Oligo(dT)₁₆(10uM)、Random(N)₆(10uM)、dNTPs(10mM)在2-8℃保存一周对实验无影响，为了你的实验方便和试剂的稳定性，请自行决定试剂存放温度。试剂解冻后请混匀离心后再使用。微量试剂打盖前请离心。

产品简介：

本试剂盒适用于各种 RNA制品的反转录反应以及随后的PCR扩增。它采用M-MLV进行反转录反应，能够获得较长的反转录产物。同时，在20ul反转录体系和50ul PCR反应体系中，还可以一次性得到足够量的PCR产物用于后续的克隆实验。本试剂盒使用方便、快捷，可广泛用于cDNA克隆及目的基因检测等分子生物学实验。

本产品配有两种引物，一种为Oligo(dT)，另一种为随机引物（Random），如果用Oligo(dT)无法得到想要的结果，可以用随机引物（Random）试一下。

 操作步骤：

一、反转录反应

1、在冰浴的无RNase的离心管（或者PCR管）中加入如下反应成分：
1-5ug总RNA或50-500ng mRNA
2ul Oligo(dT)₁₆或2ul Random(N)₆或者2 pmole基因特异性引物
补RNase-free ddH₂O至13.5ul

2、70℃保温5min后迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：
4ul   5×M-MLV Buffer
1ul   dNTPs
0.5ul  Rnasin
1ul   M-MLV

3、42℃温浴60min，如果是用随机引物，请先将离心管置25℃温浴10min，再42℃温浴60min。

4、95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或-20℃保存。

5、用RNase-free ddH₂O将反应体系稀释到50ul，取2-5ul进行PCR反应。

二、PCR反应

1、按以下各组分配制50ul PCR反应体系：
10×PCR Buffer             5ul
MgCl₂                     4ul
dNTPs                    1ul
上游引物（用户自备）
下游引物（用户自备）
RT反应产物               2ul
Taq Polymerase            0.5ul
ddH₂O                    x ul
Total Volume              50ul

2、简短离心，上PCR仪扩增，琼脂糖观察结果。

注意事项：

1、用于cDNA合成反应的相关试剂和耗材尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行过滤除菌处理。

2、试剂盒的各组分应避免反复冻融，有效期12个月。

3、RNA样品要避免反复多次冻融，应使RNA在冰浴中处于融化状态。