CCK-8试剂盒(细胞增殖及毒性检测)

Cell Counting Kit-8 简称CCK-8 试剂盒，为MTT 法的替代方法，是一种基于WST（水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏等试验。

使用说明：
一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时 （测定细胞具体数量时）
1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2、按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个复孔。
3、接种后培养至细胞贴壁，然后加 CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X 轴），OD 值为纵坐标（Y 轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间。）

二、细胞活性检测

1、在 96 孔板中接种细胞悬液（100µL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（在 37℃,5% CO2 的条件下）。

2、向每孔加入 10µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

4、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。

5、如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

三、细胞增值-毒性检测

1、在 96 孔板中配置 100 µL 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24 小时（在 37 ℃，5% CO2 的条件下）。

2、向培养板加入 10µL 不同浓度的待测物质。在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或 48 小时）。

3、向每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 OD 值的读数）。如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK-8 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。

4、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

5、用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

6、如果暂时不测定 OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10µL 0.1M 的 HCl 或者 1%SDS(W/V)溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24 小时内吸光度不会发生变化。

活力计算：.

细胞活力（％）=[A(加药)－A(空白)]／[ A(0 加药)－A(空白)]×100

A（加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培养基和 CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A（0 加药）：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项：

①建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

②白细胞可能需要培养较长时间。

③当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1 ,000 个/孔 (100 µL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 ( 100 µL 培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

④如果没有 450nm 的滤光片，可以使用吸光度在 430-490 nm 之间的滤光片，但是 450nm 检测灵敏度最高。

⑤培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。